Определение билирубина в сыворотке крови

2.Определение билирубина в сыворотке крови.

Оборудование

1.

Штатив с пробирками.

2.

Пипетки на 1 мл и 2 мл.

3.

КФК.

4.

Кюветы на 0,5 см.

Реактивы:

1.

Кофеиновый реактив

2.

Физиологический раствор

3.

Диазореактив

4.

Сыворотка крови

Принцип метода. Связанный билирубин при взаимодействии с диазореактивом (диазофенилсульфоновая кислота) образует розовое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации билирубина, вступающего в прямую реакцию. Кофеиновый реактив переводит несвязанный билирубин в растворимое состояние, благодаря чему он также реагирует с диазореактивом, образуя розовое окрашивание. По интенсивности этого суммарного окрашивания определяют концентрацию общего билирубина. А концентрацию не связанного билирубина определяют как разность между общим и связанным билирубином.

Ход работы. В 3 пробирки приливают реактивы по схеме:

Реактивы (мл)

Общий билирубин

Связанный билирубин

Контрольная проба

Сыворотка

0,5

0,5

0,5

Кофеиновый реактив

1,75

----

1,75

Физиологический раствор

----

1,75

0,25

Диазореактив

0,25

0,25

----

Через 5-10 мин после прибавления диазореактива колориметрируют пробу на связанный билирубин (при более длительном стоянии пробы в реакцию вступает несвязанный билирубин, что искажает результат). Пробу на общий билирубин колориметрируют через 20 мин после добавления диазореактива. Колориметрирование проводят при зеленом светофильтре в кювете толщиной 0,5 см против контроля. Концентрацию общего и связанного билирубина определяют по калибровочному графику.

Нормальное содержание билирубина в сыворотке: общий – 1,7-20,5 ммоль/л, связанный – 0,86-4,3 мкмоль/л, свободный – 1,7-17,1 мкмоль/л.

Диагностическое значение определения билирубина в сыворотке крови.

Причины, вызывающие гипербилирубинемию, различны. Желтуха появляется, когда уровень билирубина в крови превышает 43 мкмоль/л. Заболевания, вызывающие повышение связанного билирубина: вирусный гепатит, цирроз печени, опухоль печени и метастазы, жировая дистрофия.

Заболевания, вызывающие повышение несвязанного билирубина: гемолитическая анемия, пернециозная анемия, желтуха новорожденных.

Вопросы к защите лабораторной работы:

  1. Объясните термины: общий билирубин, свободный билирубин, связанный билирубин, прямой билирубин, непрямой билирубин, конъюгированный билирубин, некоъюгированный билирубин.

  2. Как образуется свободный билирубин?

  3. Зачем в данном методе используется кофеиновый реактив?

  4. Почему пробу на связанный билирубин колориметрируют точно через 5-10 минут?

  5. Каков принцип метода определения билирубина в сыворотке крови?

  6. Как определяют концентрацию общего и связанного билирубина?

  7. Назовите причины гипербилирубинемии.

  8. Какова норма свободного, связанного и общего билирубина?

StudFiles.ru

3. Исследование порфиринового (пигментного) обмена

Для оценки состояния порфиринового обмена используют определение пигмента билирубина, являющегося продуктом распада гемпротеидов. Существуют два типа билирубина: неконъюгированный (свободный, который с диазореактивом дает непрямую реакцию, т.е. после растворения в этаноле) и конъюгированный (связанный с глюкуроновой кислотой, который сразу реагирует с диазореактивом). По соотношению фракций билирубина судят об изменении пигментного обмена.

Работа 65. Определение билирубина и его фракций в сыворотке крови по Йендрашику, Клеггорну и Грофу

Реактивы. Кофеиновый реактив*; хлорид натрия, 9 г/л раствор; диазореактив*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на способности связанной и диссоциированной формы свободного билирубина давать при взаимодействии с диазофенилсульфоновой кислотой азобилирубин розовато-фиолетового цвета. Свободный билирубин переводится в растворимое диссоциированное состояние кофеиновым реактивом, благодаря чему в этой пробе определяется общий билирубин. По разнице между общим и связанным билирубином находят концентрацию свободного билирубина.

Ход определения. В три пробирки вносят согласно таблице необходимые ингредиенты и тщательно перемешивают.

Реактивы

Общий билирубин, мл

Связанный билирубин, мл

Контроль, мл

Сыворотка

0,50

0,50

0,50

Кофеиновый реактив

1,75

-

1,75

Раствор хлорида натрия

-

1,75

0,25

Диазореактив

0,25

0,25

-

При определении общего билирубина пробы оставляют стоять на 20 мин для развития окраски, а связанного – на 5-10 мин (при длительном стоянии в реакцию вступает свободный билирубин).

По истечении указанного времени фотометрируют каждую пробу против воды на ФЭКе при 520-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Расчет. Из полученных экстинкций общего и связанного билирубина вычитают экстинкцию контрольной пробы (контроль на мутность сыворотки) и находят по ним содержание общего и связанного билирубина (в мкмоль/л) по калибровочному графику (рис. 11). Свободный (неконъюгированный) билирубин рассчитывают по разнице между величинами общего и связанного билирубина.

Оформление работы. Рассчитать содержание общего билирубина и его фракций в сыворотке крови и сделать вывод о причине возможных отклонений этих показателей в исследуемом материале.

Практическое значение работы. В норме концентрация общего билирубина в сыворотке крови составляет 8,0-20,0 мкмоль/л; из этого количества 75% приходится на долю неконъюгированного (свободного) билирубина (6,0-15,0 мкмоль/л) и 25% – на долю конъюгированного (связанного) билирубина (2,0-5,0 мкмоль/л). Исследование содержания билирубина проводится в клинике для дифференциальной диагностики желтух. Желтушная окраска кожных покровов проявляется при уровне билирубина в крови выше 27 мкмоль/л. При надпеченочных желтухах (гемолитические анемии, желтуха новорожденных и др.) увеличивается содержание свободного билирубина в крови, при печеночных желтухах, возникающих вследствие поражения собственно клеток печени, повышается концентрация связанного билирубина в крови, а при подпеченочных желтухах, к которым относится механическая, наблюдается возрастание уровня как свободного, так и, в большей степени, связанного билирубина.

StudFiles.ru

Определение прямого билирубина сыворотки крови

Ход работы. К 1 мл сыворотки крови прибавить 3,5 мл физраствора и 0,5 мл диазореактива. Через 5 минут полученную смесь помещают в кювету с толщиной 1 см и фотометрирует на ФЭКе при зеленом светофильтре против компенсационного раствора, содержащего 1 мл сыворотки, 3,5 мл физраствора и 0,5 мл воды. Норма: общий - 8,2-20,5 мкмоль/л или 0,5-0,9 мг% (75%-непрямой от общего билирубина);

прямой - 2,1-6,3 мкмоль/л;

непрямой -6,1- 14,2 мкмоль/л.

Клинико-диагностическое значение. Повышение концентрации билирубина в крови до 20 мг/л приводит к развитию желтухи. Боле высокий уровень билирубина в крови вызывает явление тяжелого отравления. В крови количество и соотношение между прямым и непрямым билирубином резко меняются при поражениях печени, селезенки, костного мозга, болезнях крови и т.д., поэтому определение обеих форм билирубина в крови имеет существенное значение в клинике при дифференциальной диагностике желтух различной этиологии.

Диагностика желтух

Таблица 1

Признак

Желтухи

механическая

паренхиматозная

гемолитическая

Свободный билирубин крови

Не изменен

Незначительно повышен

Резко повышен

Связанный билирубин крови (глюкуронид)

Резко повышен

Значительно повышен

Незначительно повышен

Билирубин мочи (глюкуронид, прямой)

Значительно повышен

Незначительно повышен

Не изменен

Уробилиноген мочи

Не изменен или снижен

Значительно повышен

Резко повышен

Стеркобилин кала

Снижен

Снижен или тот же

Тот же

Проба Гмелина на желчные пигменты

Ход работы. В пробирку наливают 10 капель концентрированной азотной кислоты содержащей следы азотистой кислоты и осторожно, пипеткой наслаивают на нее исследуемую мочу (примерно 1 мл). При наличии в моче желчных пигментов на границе кислоты и мочи появляется слой цветных колец, возникающих в результате образования продуктов окисления билирубина. Особенно характерным является зеленое кольцо.

Диагностическое значение анализа. Увеличение содержания билирубина в крови (гипербилирубинемия) наблюдается при желтухах (гемолитической, обтурационной, печеночно-клеточной).

Проба Богомолова на уробилин

Ход работы. К 10-15 мл мочи прибавить 2-3 млнасыщенного раствора сульфата меди. Если получается помутнение от образовавшегося гидроксида меди, то прибавить несколько капель соляной кислоты до просветления раствора. Через 5 минут прибавить 2-3 мл хлороформа или толуола и взболтать.

Диагностическое значение анализа. Уробилин - продукт окисления бесцветного уробилиногена, в малых количествах выделяется с мочой (3, 2 мг). Определение концентрации желчных пигментов в моче имеет значение для дифференциации видов желтух: увеличение – гемолитическая желтуха, отсутствие - обтурационная желтуха.

Контрольные вопросы к теме биохимия печени

1. Роль печени в углеводном обмене.

2. Роль печени в липидном обмене.

3. Роль печени в белковом обмене.

4. Механизм детоксикации чужеродных веществ в печени.

5. Химический состав желчи.

6. Какие «защитные» синтезы протекают в печени?

7. Участие печени в обмене а) головного мозга; б) мышечной ткани; г) почек.

8. Как осуществляется распад гемоглобина в тканях?

9. Какие вещества называют желчными пигментами?

10. Напишите формулу билирубина. Что такое «прямой» и «непрямой» билирубин? Каковы их синонимы?

11. В каком организме происходит образование билирубинглюкуронидов? В чем биологический смысл этого процесса?

12. Напишите реакцию образования билирубин-диглюкуронида.

13. Каково содержание билирубина в сыворотке крови в норме?

14. Перечислите виды желтух. Лабораторная диагностика желтух.

15. Какие превращения происходят с билирубином в кишечнике?

16. Какие продукты превращения билирубина можно обнаружить в моче в норме и при патологии?

StudFiles.ru

Опыт 2. Определение билирубина в сыворотке крови по диазореакции в присутствии акцелератора (метод Иендрашика, Клетгорна и Грофа)

Билирубин является одним из промежуточных продуктов распада гемоглобина, происходящего в макрофагах селезёнки, печени и костном мозге. Билирубин слаборастворим в воде, в плазме билирубин первично появляется в неконъюгированной форме, связанный с альбумином (непрямой, свободный билирубин). В клетках печени непрямой билирубин конъюгируется с глюкуроновой кислотой и превращается в билирубинмоно- и билирубиндиглюкоронид (конъюгированный, прямой, связанный билирубин). Конъюгированный билирубин водорастворим, он поступает с желчью в желчный пузырь или непосредственно в кишечник. «Прямой» билирубин дает с диазореактивом комплексное соединение розово-фиолетового цвета. «Непрямой» билирубин реагирует с диазореактивом только после добавления кофеинового реактива.

Нормальная моча содержит минимальное количество конъюгированного билирубина (7-20 мкг/л), не выявляемое качественными методами.

В сыворотке крови прямой билирубин и непрямой билирубин вместе образуют общий билирубин крови, определение которого имеет важное значение в лабораторной диагностике. Нормы общего билирубина: 0,5-1,2 мг%, или 8,6-20,5 мкмоль/л. Из него 75% приходится на долю непрямого. Желтуха развивается, если уровень билирубина в плазме крови превышает пороговое значение (примерно 34 мкмоль/л или 20 мг/л), и билирубин начинает связываться эластическими волокнами кожи и конъюктивы. В зависимости от механизма образования различают несколько видов желтух.

Ход работы: в трех пробирках готовят смеси для определения билирубина согласно таблице 1.

Таблица 1.

Ингредиенты (в мл) «Общий билирубин» «Прямой» билирубин Контроль
Сыворотка крови 0,5 0,5
Кофеиновый реактив 1,75 - 1,75
0,9% раствор хлорида натрия - 1,75 0,25
Диазосмесь 0,25 -

Для определения «прямого» билирубина фотоколориметрирование проводят через 5-10 минут. Измеряют оптическую плотность раствора на фооэлектроколориметре при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) против контроля.

Для определения «общего» билирубина пробу колориметрируют через 20 минут.

Для построения калибровочного графика из рабочего стандартного раствора билирубина готовят ряд разведений согласно таблице 2.

Таблица 2.

№ пробирки Рабочий раствор билирубина, мл 0,9% раствор хлорида натрия, мл Количество билирубина в пробе, мг Концентрация билирубина, мг%
0,05 0,45 0,005
0,10 0,40 0,010
0,15 0,35 0,015
0,20 0,30 0,020
0,25 0,025

Обрабатывают, как опытные пробы.

По калибровочному графику находят концентрацию «общего» и «прямого» билирубина в сыворотке крови. По разнице этих двух величин содержание находят «непрямого» билирубина. Сравнивают с нормальными значениями.

Контрольные вопросы

1. Приведите уравнения нейтрализации ацетоуксусной и 3-гидроксимасляной кислот аммиаком.

2. Дефект какого из ферментов орнитинового цикла может быть причиной увеличения суточной экскреция аргининосукцината?

3. Почему при поражениях печени наблюдается аминоацидурия?

4. Какова химическая природа билирубина?

5. При каких обстоятельствах в моче может обнаружиться билирубин?

6. При каком виде желтухи происходит обесцвечивание кала? Почему?

studopedia.ru

Читайте также