Методика определения резус фактора

/ 29

29 Методы определения групп крови и резус-фактора. Профилактика возможных ошибок

Определение групп крови с помощью стандартных сывороток. В лунки планшета для определения групп крови последовательно наносят пипетками по одной крупной капле стандартной сыворотки групп 0(1), А(П), В(Ш) двух различных серий каждой группы. Затем наносят в каждую лупку по капле исследуемой крови, в 5 — 10 раз меньшую сыворотки. Сухими стеклянными палочками или путем покачивания планшета смешивают стандартные сыворотки и исследуемую кровь. Через 5 минут оценивают результат (табл. 2).

Таблица 2

Определение групп крови с помощью стандартных сывороток

Группа исследуемой крови

Стандартные сыворотки

0(I)

А(II)

В (III)

0(I)

-

-

-

А(II)

+

-

+

В(III)

+

+

-

AB(IV)

+

+

+

Определение групп крови по стандартным эритроцитам. В лунки планшета наносят большие капли плазмы исследуемой крови. Рядом с каждой каплей плазмы последовательно наносят по небольшой капле стандартных эритроцитов групп 0(1), А(II), В(III). Капли перемешивают покачиванием планшета. Через 5 минут к каждой капле смеси добавляют по 1 капле физиологического раствора и учитывают результат.

Таблица 3

Определение групп крови с помощью стандартных эритроцитов

Группа исследуемой крови

Стандартные эритроциты

0(I)

А(II)

В (III)

0(I)

-

+

+

А(II)

-

-

+

В(III)

-

+

-

AB(IV)

-

-

-

Определение резус-фактора. На дно сухой пробирки наносят 1 большую каплю универсального реагента анти-резус, затем добавляют такую же каплю исследуемой крови. После встряхивания пробирки производят перемешивание сыворотки анти-резус и крови в течение 5 минут по стенкам пробирки, после чего добавляют 5 — 7 мл физиологического раствора. Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии резус-фактора.

Определение групп крови с помощью цоликлонов. Цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ предназначены для определения групп крови человека системы АВО в прямых реакциях гемагглютинации и применяются взамен или параллельно с поликлональными иммунными сыворотками.

Моноклональные анти-А и анти-В антитела продуцируются двумя мышиными гибридомами и принадлежат к иммуноглобулинам класса М. Цоликлоны изготовляются из асцитной жидкости мышей-носителей анти-А и анти-В гибридом. Цоликлон анти-АВ представляет собой смесь моноклональных анти-А и анти-В антител.

Цоликлоны выпускаются в жидкой форме во флаконах объемом 5 — 10 мл. Цоликлон анти-А — желтого цвета, анти-В — синего, анти-АВ — бесцветный. В качестве консерванта применяется азид натрия.

Техника определения групп крови. Определение производится в нативной крови, взятой в консервант; в крови, взятой без консерванта, в том числе из пальца. Используется метод прямой гемагглютинации на пластине или планшете, определение производится в помещении с хорошим освещением при температуре 15 — 25 X.

  1. Наносят на пластину или планшет индивидуальными пипетками цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями.

  2. Рядом с каплями антител наносят по одной маленькой капле исследуемой крови (0,01 — 0,03 мл).

  3. Смешивают кровь с реагентом, покачивая планшет.

  4. Наблюдают за ходом реакции с цоликлонами визуально при легком покачивании планшета в течение 3 минут. Агглютинация эритроцитов с цоликлонами обычно наступает в первые 3 — 5 секунд, но наблюдение следует вести 3 минуты ввиду более позднего появления агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые разновидности антигенов А или В.

  5. Результат реакции в каждой капле может быть положительным или отрицательным. Положительный результат выражается в агглютинации (склеивании) эритроцитов. Агтлютинаты видны в виде мелких красных агретатов, быстро смешивающихся в крупные хлопья. При отрицательной реакции капля остается равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты в ней не обнаруживаются.

  6. Интерпретация результатов реакции агглютинации с цоликлонами представлена в табл. 4.

Таблица 4

Определение групп крови с помощью цоликлонов

Группа исследуемой крови

Стандартные эритроциты

Анти-А

Анти-В

Анти-АВ

0(I)

_

_

-

А(II)

+

-

+

В(III)

-

+

+

АВ(IV)

+

+

+

Примечание: знаком (+) обозначено наличие агглютинации, знаком (-) — се отсутствие

При положительном результате реакции агглютинации со всеми гремя цоликлонами необходимо исключить спонтанную неспецифическую аглютинацию исследуемых эритроцитов. Для этого смешивают на плоскости 1 каплю исследуемых эритроцитов с каплей физиологического раствора. Кровь можно отнести к группе AB(IV) только при отсутствии агглютинации эритроцитов в физиологическом растворе.

Определение резус-фактора с помощью цоликлона. В лупку планшета наносят 1 большую каплю цоликлона анти-Д-суперт рядом наносят 1 маленькую каплю исследуемой крови.

Покачивая планшет, смешивают кровь с цоликлоном. За ходом реакции наблюдают в течение 3 минут. Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии резус-фактора.

StudFiles.ru

Определение в крови резус-фактора

Определение в крови резус-фактора производится врачами, прошед­шими специальную подготовку на СПК и получившими сертификат.

Резус-фактор определяется с помощью стандартной сыворотки, в ко­торой содержатся активные резус-антитела. Эта сыворотка готовится из крови лиц, сенсибилизированных к резус-фактору, это:

• резус-отрицательные женщины, сенсибилизированные к резус-фактору резус-положительным плодом во время беременности;

• доноры, у которых в крови обнаружены резус-антитела;

• лица, специально иммунизированные резус-антигеном;

• лица, перенесшие трансфузионные реакции или осложнения в связи с резус-конфликтом, в крови которых могут содержаться активные резус- антитела.

Готовая антирезусная сыворотка выпускается в ампулах или флако­нах по 2-5 мл с наклеенными этикетками, на которых указано учреждение - изготовитель, номер серии, обозначена группа по системе AB0, специфич­ность, форма резус-антител и срок годности. На этикетках, по диагонали, наносят те же цветные полосы, что и на стандартных гемагглютинирующих сыворотках.

Сывороткой антирезус 0(I) группы определяют резус-фактор только в эритроцитах первой группы, сывороткой антирезус А(II) группы - в эритроцитах первой и второй групп, а сывороткой антирезус В (III) группы в эритроцитах первой и третьей группах крови. Сывороткой антирезус группы АВ(IV), специально приготовленной (универсальной), определяют резус-фактор в эритроцитах группы АВ(IV) и в других группах крови по системе AB0.

При каждом исследовании на резусную принадлежность необходимо ставить контроль для проверки специфичности и активности сыворотки антирезус. Для контроля применяют стандартные резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты первой или той же группы, что и иссле­дуемая кровь.

Кровь для исследования берут, в количестве 5 мл, в обычную про­бирку без стабилизатора. На пробирке надписывают фамилию, инициалы, группу крови лица, у которого взята кровь, отделение и дату. После свер­тывания крови на дне образуется сгусток из эритроцитов, которые и следу­ет брать для исследования. Если этих эритроцитов недостаточно, следует встряхнуть сгусток для отделения большего их количества.

Можно брать кровь с изотоническим раствором лимоннокислого на­трия (0,25 мл на 1 мл крови), но в этом случае необходимо отмыть эритро­циты. Для этого в пробирку доверху наливают изотонический раствор хло­ристого натрия, хорошо перемешивают и центрифугируют. Отмытые эрит­роциты берут для исследования.


Стандартные антирезусные сыворотки активны только в определен­ных условиях, поэтому методика определения резус-фактора этими сыво­ротками указывается в сопроводительной инструкции. Резус-фактор в крови можно определять следую­щими способами:

• с помощью универсального реагента в пробирках без подогрева;

• реакцией с применением 10% желатина в пробирках с подогревом (+46- 48°С);

• реакцией агглютинации в солевой среде;

• с помощью цоликлона анти-Д Супер.

На практике чаще пользуются первым способом. Стандартный уни­версальный реагент представляет собой смесь сыворотки АВ(IV) группы крови и 33% раствора полиглюкина в соотношении 2:1. Его приготавлива­ют на СПК. Универсальный реагент не содержит групповых агглютининов (в сыворотке АВ(IV) группы крови их нет), поэтому он может быть ис­пользован для определения резус-антигена Д в эритроцитах любой группы крови системы AB0. Исследованию может подвергаться кровь, взятая из пальца, консервированная кровь и осадок эритроцитов в пробирке с кро­вью, взятой без стабилизатора, но после образования сгустка.

Методика проведения реакции:

1. В штатив устанавливают два ряда центрифужных пробирок объе­мом до 10 мл, по количеству образцов эритроцитов. Дополнительно уста­навливают еще две пробирки, для контроля реакции с резус- положительными и резус-отрицательными эритроцитами. Попарно, из первого и второго ряда пробирок, производят надписи фамилии и инициа­лов лиц, у которых исследуют кровь.

2. Во все пробирки первого ряда и в две контрольные пробирки вно­сят по две капли стандартного универсального реагента-антирезус; во все пробирки второго ряда вносят по две капли изотонического раствора хло­ристого натрия и по одной капле 33% раствора полиглюкина;

3. В пробирки первого и второго ряда вносят по одной капле иссле­дуемых эритроцитов; в первую контрольную пробирку вносят одну каплю стандартных резус-положительных эритроцитов, во вторую контрольную пробирку - такую же каплю стандартных резус-отрицательных эритроци­тов.

4. Пробирки встряхивают, затем медленно поворачивают по оси, на­клоняя почти до горизонтального уровня, чтобы содержимое растекалось по стенкам пробирки, что делает реакцию более выраженной.

Оценка результатов исследования:

Агглютинация может появиться уже на первой минуте, но ожидать необходимо три минуты, так как реакция может быть замедленной. Через три минуты в пробирки наливают по 2-3 мл изотонического раствора хло­ристого натрия, перемешивают двух - трехкратным плавным переворачи­ванием пробирок (не встряхивать!). Пробирки просматривают на свет не­вооруженным глазом или через лупу, выявляя наличие или отсутствие агг­лютинации эритроцитов. Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой антирезус, считаются резус-положительными, а не давшие агг­лютинации - резус-отрицательными.

В контрольных пробирках должна произойти аналогичная реакция - отсутствие агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритро­цитами и наличие ее со стандартными резус-положительными эритроци­тами. В пробирках второго ряда агглютинации быть не должно. Наличие агглютинации указывает на возможность ее появления за счет аутоантител. В таких случаях следует повторить реакцию с эритроцитами, отмытыми в теплом изотоническом растворе хлористого натрия, для удаления с них ау­тоантител. При сомнительном результате определения резус- принадлежности, следует применить метод агглютинации в солевой среде с использованием сыворотки антирезус, содержащей полные антитела, или провести исследование с цоликлонами анти-Д Супер.

Определение резус-принадлежности крови только по сыворотке анти-Д считается недостаточным. В случаях резус-отрицательной реакции необходимо дополнительное исследование сыворотками, содержащими антитела анти-С и анти-Е. В число резус-отрицательных засчитываются только лица, кровь которых не содержит ни одного из этих антигенов. Это особенно важно при обследовании доноров, беременных женщин с подоз­рением на изосенсибилизацию и некоторых других категорий больных.

Реакция агглютинации на плоскости

с помощью цоликлонов анти-D супер

1. Наносят большую каплю (около 0,1 мл) реагента на пластинку или планшет.

2. Наносят рядом маленькую каплю (0,02-0,03 мл) исследуемых эритроцитов. Тщательно смешивают реагент с эритроцитами стеклянной палочкой.

3. Через 10-20 секунд мягко покачивают пластинку.

4. Результаты реакции учитывают через 3 минуты после смешивания, несмотря на то, что четкая агглютинация наступает в первые 30 секунд.

5. При наличии агглютинации исследуемая кровь маркируется как резус положительная, при отсутствии - как резус отрицательная.

6. Для определения резус-принадлежности ускоренным методом на плоскости при комнатной температуре могут быть использованы поликлональные сыворотки анти-D с неполными антителами, приготовленные в комбинации с коллоидами (альбумином, полиглюкином).

Цоликлон анти-D супер выпускается во флаконах по 2,5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). Срок хранения — 1 год в холо­дильнике при t 2~8 °С. Вскрытый флакон можно хранить в хо­лодильнике в течение месяца в закрытом виде.

studopedia.ru

Определение резус-фактора

Под определением резус-фактора у пациента подразумевается определение только Rhо(D).Резус-отрицательными считаются лица, у которых RhоD не обнаружен.

В отличие от реципиентов, определение резус-принадлежности крови доноров проводится в два этапа: сначала определяется наличие Rhо(D), а затем, при его отсутствии - rh'(C) и rh''(E).

В число резус отрицательных доноров зачисляются только лица, кровь которых не содержит всех трех доминантных антигенов системы Резус: Rhо(D), rh'(C), rh''(E), то есть имеет фенотип Hro(d), hr'(c), hr''(e).

Поскольку антирезусные антитела обычно бывают неполными, в большинстве способов создаются дополнительные условия, облегчающие реакцию взаимодействия антиген-антитело — коллоидная среда, повышенная температура (см. Приложение).

Разработано несколько реагентов для определения Rho(D) фактора. В большинстве случаев эти реагенты лишены групповых антител системы АВО (не имеют групповой специфичности) и называются «универсальными».

До 70-х годов ХХ столетия определение Rhо(D) производилось с помощью«Сывороток антирезус» с групповой специфичностью (антирезусных сывороток). Использование их было весьма неудобным, поскольку необходимо было сначала определить группу крови по системе АВО, а затем подобрать совместимую сыворотку для определения резус-фактора:

Сыворотки антирезус изготовлялись из крови специально отобранных резус-отрицательных доноров, ранее сенсибилизированных к антигену Rh вследствие резус-конфликтных беременностей, переливания резус-положительной крови или специально иммунизированных малыми дозами одногруппной резус-положительной крови.

Поскольку изготовление реагентов для определения резус - принадлежности связано с риском для здоровья (сенсибилизацией) доноров, они не могут выпускаться большими партиями. Кроме того, определение резус-фактора с помощью антирезусных сывороток было длительным (10 мин) и трудоемким (на водяной бане).

В настоящее время в России повсеместно используется определение резус-принадлежности при помощи стандартного универсального реагента,содержащего антирезусную сыворотку группы АВ(IV), которая не содержит естественных агглютининов α и β и коллоидную среду (33% полиглюкин), необходимую для выявления неполных антител.

В целях экономии реагента в лечебных учреждениях первичное определение резус - принадлежности проводится централизовано в отделениях переливания крови или клинических лабораториях. В отделениях лечебных учреждений определение резус - принадлежности выполняется при контрольной проверке Rh- фактора донора (из контейнера с эритроцитами) и реципиента при проведении гемотрансфузий.

Определение резус - принадлежности при помощи стандартного универсального реагента (в пробирках без подогрева).

Реакция с ним происходит быстрее (3 мин), чем с антирезусными сыворотками, поэтому получила название «экспресс -реакции» или «экспресс-метода».

В пробирку вносят по 2 капли (0,1 мл) стандартного универсального реагента антирезус и 1 каплю (0,05 мл) исследуемой крови.

Содержимое пробирки перемешивают встряхиванием и затем медленно поворачивают по оси, наклонив почти до горизонтального положения так, чтобы содержимое растекалось по стенкам.

Через 3 минуты в пробирки добавляют по 2-3 мл изотонического раствора хлорида натрия и перемешивают 2-3-кратным переворачиванием пробирок, не встряхивая. Пробирки просматривают на свет.

При наличии агглютинации и просветлении раствора резус-фактор считают положительным, при отсутствии агглютинации и равномерном розовом окрашивании раствора — отрицательным.

Исследование других антигенов системы Резус проводится теми же способами специальными реагентами, содержащими соответствующие антитела.

StudFiles.ru

Техника определения резус – фактора экспресс - методом

Цель:определение резус- фактора.

Показания:гемотрансфузия.

Приготовить:пипетки, пробирки, физиологический раствор, универсальный антирезус-реагент, скарификатор, стерильные марлевые шарики, спирт, стерильный пинцет, стерильные перчатки, песочные часы.

Алгоритм действия:

  1. Внести пипеткой 2 капли сыворотки в конусную пробирку;
  1. Добавить пипеткой 1 каплю крови;
  1. Встряхнуть пробирку;
  1. Добавить в пробирку 2 капли физиологического раствора;
  1. Встряхнуть пробирку или вращать между ладонями в течении 5 минут;
  1. Посмотреть на стенки пробирки и оценить результат. Если есть реакция, то у пациента резус-положительный фактор.

Примечание: температура воздуха должна быть в пределах 15- 25о С для профилактики ложной агглютинации.

Можно произвести определение резус-принадлежности с помощью цоликлона анти-Д

Техника постановки пробы на индивидуальную совместимость по АВ0

Цель:определить совместимость крови донора с кровью реципиента.

Показания:гемотрансфузия.

Приготовить:донорская кровь, сыворотка крови реципиента, стеклянные палочки, пипетки, чашка Петри, шприц, игла, стерильные марлевые шарики, спирт, стерильный пинцет, стерильные перчатки, песочные часы.

Алгоритм действия:

  1. Взять у пациента кровь до 5 мл в пробирку из вены;
  2. Отцентрифугировать пробирку с кровью для получения сыворотки;
  3. Нанести пипеткой на тарелку 1 каплю сыворотки пациента и мазок крови донора;
  4. Смешать стеклянной палочкой сыворотку и кровь;
  5. Добавить 1 каплю физиологического раствора;
  6. Наблюдать за реакцией в течении 5 минут.
  7. Если нет агглютинации, то проба отрицательная и кровь совместима и ее можно переливать.

Техника постановки пробы на индивидуальную совместимость по резус – принадлежности

Цель:определить совместимость крови донора с кровью реципиента.

Показания:гемотрансфузия.

Приготовить:донорская кровь, сыворотка крови реципиента, стеклянные палочки, водяная баня, пипетки, чашка Петри, шприц, игла, стерильные марлевые шарики, спирт, стерильный пинцет, стерильные перчатки, песочные часы.

Алгоритм действия:

  1. Взять у больного кровь до 5 мл в пробирку;
  2. Отцентрифугировать пробирку с кровью больного для получения сыворотки;
  3. Нанести пипеткой на чашку Петри 1 каплю сыворотки больного и каплю крови донора;
  4. Смешать стеклянной палочкой сыворотку с кровью;
  5. Добавить 1 каплю физиологического раствора;
  6. Поставить чашку Петри на водяную баню (температура – 50С);
  7. Ждать результат в течении 10 минут.
  8. Если агглютинация отсутствует, то проба отрицательная и переливать кровь можно.

studopedia.ru

Читайте также