Определение резус фактора цоликлонами

Методика определения группы крови с помощью цоликлонов

Различают цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ. Они представляют собой моноклональные антитела, которые продуцируются двумя мыши­ными гибридомами, принадлежат к иммуноглобулинам класса М и предна­значены для определения группы крови человека по системе AB0. Цоликлоны изготавливаются из асцитической жидкости мышей - носителей анти-А и анти-В гибридом, являются строго специфичными и, следователь­но, не могут вызывать неспецифическую агглютинацию эритроцитов. Тех­нология приготовления реагента исключает возможность попадания в него патогенных для человека вирусов.

Цоликлон анти-АВ представляет собой смесь моноклональных анти- А и анти-В антител. Цоликлоны выпускают в жидкой форме во флаконах по 5-10 мл. Цоликлоны анти-А подкрашены в красный цвет, анти-В - в си­ний, анти-АВ не подкрашивают, он остается бесцветным. Срок хранения цоликлонов при температуре +2-8°С составляет два года, вскрытый флакон может храниться при той же температуре в течение одного месяца в за­крытом виде.

Условия определения группы крови цоликлонами аналогичны опи­санным выше способам. На пластинку индивидуальными пипетками, под соответствующими надписями, наносят по одной большой капле (0,1 мл) цоликлонов анти-А, анти-В и анти-АВ. Рядом с каплями размещают по од­ной маленькой капле исследуемой крови (0,01-0,03 мл). Затем проводят смешивание капель отдельными палочками. Наблюдают за ходом реакции в течение трех минут, хотя агглютинация может появиться через три - шесть секунд, но возможна и поздняя реакция агглютинации, при наличии в эритроцитах слабых антигенов А или В.

Результат реакции в каждой капле может быть положительным или отрицательным. Положительный результат выражается в агглютинации эритроцитов. Агглютинаты видны невооруженным глазом в виде мелких красных комочков, быстро сливающихся в крупные хлопья. При отрица­тельной реакции капля остается равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты в ней не обнаруживаются.

Интерпретация результатов реакции агглютинации крови с цоликлонами представлена в таблице 5.

Таблица 5. Определение группы крови с помощью цоликлонов
Результат реакции с цоликлонами Исследуемая кровь принадлежит к группе
Анти-А Анти-В Анти-АВ
- - 0(I)
+ - + A(II)
- + B(III)
+ + AB(IV)

Оценка результатов исследования:

1. Отсутствие агглютинации во всех каплях свидетельствует о том, что в исследуемых эритроцитах нет агглютиногенов А и В, и исследуемая кровь принадлежит к 0(I) группе.

2. Наличие агглютинации в каплях с анти-А и анти-АВ свидетельствует о том, что в исследуемых эритроцитах имеется антиген А и кровь принадлежит к A(II) группе.

3. Наличие агглютинации в каплях с анти-В и анти-АВ свидетельствует о том, что в исследуемых эритроцитах имеется антиген В и кровь принадлежит к В (III) группе.

4. Наличие агглютинации во всех каплях свидетельствует о том, что в исследуемых эритроцитах имеются оба антигена (А и В) и кровь при­надлежит к АВ(IV) группе. В таких случаях необходимо исключить спонтанную неспецифическую агглютинацию исследуемых эритроци­тов. Для этого производят смешивание маленькой капли исследуемой крови с каплей изотонического раствора хлористого натрия (в соот­ношении 1:10) и, отдельно, проверяется реакция с сывороткой четвер­той группы крови. При отсутствии агглютинации эритроцитов в фи­зиологическом растворе и в сыворотке четвертой группы можно ут­верждать, что исследуемая кровь принадлежит к АВ(IV) группе. Про­водить отдельно контроль с растворителем цоликлонов не требуется, поскольку в нем нет каких-либо добавок, способных вызвать агглю­тинацию эритроцитов.


studopedia.ru

/ алгоритм 7 определение группы крови с цоликлонами

Определение группы крови с цоликлонами анти-А и анти-Б

1Вступительное слово: Мы проводим определение группы крови с цоликлонами в процедурном кабинете по назначению врача. На мне шапочка, очки, маска, халат, фартук, перчатки. Руки предварительно обработаны гигиеническим способом.

2 Оснащение:

  1. Цоликлоны анти-А, анти-Б

  2. Исследуемая кровь (пробирка)

  3. Тарелка для определения группы крови.

  4. Стерильные стеклянные палочки 2 шт ( в стакане, чашке Петри)

  5. Изотонический раствор натрия хлорида

  6. Стерильная пипетка 1 шт.

  7. Стерильный капилляр с грушей.

  8. Ёмкость с 3% раствором хлорамина.

3 Техника манипуляции:

  1. Внести цоликлоны в отдельные лунки по одной большой капле.

  2. Внести капилляром маленькие (0,01 мл) капли крови рядом с каплями цоликлонов, избегая контакта капилляра и крови.

  3. Отдельными палочками смешать цоликлоны и кровь.

  4. Покачивать тарелку, наблюдать агглютинацию 2,5 минуты.

  5. Внести пипеткой в лунки, в которых произошла агглютинация по 1й капле физиологического раствора

  6. Покачивать, наблюдать агглютинацию.

  7. Форма ответа:

При определении группы крови с помощью цоликлонов …

  1. Агглютинация не наблюдается ни в одной из лунок – первая группа

  2. Агглютинация наблюдается с цоликлоном анти-А – вторая группа

  3. Агглютинация наблюдается с цоликлоном анти-Б – третья группа

  4. Агглютинация наблюдается с цоликлонами анти-А и анти-Б – четвертая группа

  1. После проведения манипуляции все использованные предметы замачиваются в емкости с трехпроцентным раствором хлорамина.

4 Возможные ошибки:

Грубые ошибки:

  1. Не использование средств защиты медработника.

  2. Повторное использование палочек.

  3. Перенос палочек, контактировавших с кровью над лотком с чистыми палочками.

  4. Не соответствие картины агглютинации заключению о групповой принадлежности.

  5. Не продезинфицированы предметы, контактировавшие с кровью.

Не грубые ошибки:

  1. Время ожидания агглютинации менее 2.5 мин.

  2. Не внесен физраствор в лунки, в которых произошла агглютинация.

  3. Удерживание палочек за концы, а не за центр.

5 Критерии оценивания:

Сдал – отсутствие грубых ошибок, наличие не более двух не грубых ошибок.

Не сдал – наличие грубых ошибок, наличие более двух не грубых ошибок.

При совершении грубой ошибки преподаватель может попросить повторить соответствующий этап манипуляции. Если ошибка повторяется – не сдал. Допускается не более одного повторения.

StudFiles.ru

Определение группы крови и резус-фактора Определение групп крови по стандартным изогемагглютинирующим сывороткам

Для определения групповой принадлежности крови необходимо следующее оснащение: два комплекта стандартных гемагглютинирующих сывороток I(0), II(А), III (В) групп двух различных серий и одна ампула сыворотки IV(АВ) (в каждую ампулу с сывороткой опускают сухую чистую пипетку), флакон с изотоническим раствором хлорида натрия с пипеткой, чисто вымытая сухая тарелка, предметные стекла, стерильные копьевидные иглы для прокола кожи пальца, стерильные марлевые шарики, спирт. Определение проводят в помещении с хорошим освещением, при температуре от 15 до 25 ° С.

Каждая ампула стандартной сыворотки должна иметь паспорт-этикетку с указанием группы крови, номера серии, титра, срока годности, места изготовления. Ампулой без этикетки пользоваться запрещается. Стандартные сыворотки для определения группы крови по системе АВ0 выпускают с определённой цветовой маркировкой: I(0) - бесцветная, II (А) - голубая, III (В) - красная, IV(АВ) - жёлтая. Маркировка имеется на этикетке в виде цветных полос: на этикетке сыворотки I(0) полос нет, сыворотки II (А) - две полосы синего цвета, сыворотки III (В) - три полосы красного цвета и сыворотки IV(АВ) - четыре полосы жёлтого цвета. Сыворотки хранят при температуре 4-10 ° С. Сыворотка должна быть светлой и прозрачной, ампула - сохранной. Наличие хлопьев, осадка, помутнения являются признаками непригодности сыворотки. Титр сыворотки должен быть не менее 1:32, активность - высокая: первые признаки агглютинации должны появляться не позднее чем через 30 с. Сыворотки с истекшим сроком хранения к использованию непригодны.

Тарелку делят цветным карандашом на четыре квадрата и в направлении по часовой стрелке обозначают квадраты I(0), II (А), III (В). В соответствующий квадрат тарелки пипеткой наносят крупную каплю сыворотки двух серий I(0), II (А), III (В) групп. Подушечку пальца обрабатывают спиртом и делают прокол кожи иглой-копьём. Первую каплю крови снимают марлевым шариком, последующие капли разными уголками предметного стекла вносят последовательно в капли сыворотки и тщательно размешивают. Капля вносимой крови должна быть в 5-10 раз меньше капли сыворотки. Затем путём покачивания тарелки тщательно перемешивают кровь с сывороткой. Предварительные результаты оценивают через 3 мин, после чего добавляют каплю изотонического раствора хлорида натрия, вновь смешивают путём покачивания тарелки и через 5 мин проводят окончательную оценку реакции агглютинации (рис. 37, см. цв. вкл.).

При положительной реакции изогемагглютинации хлопья и зёрнышки из склеившихся эритроцитов не расходятся при добавлении изотонического раствора хлорида натрия и перемешивании. При отрицательной реакции капли сыворотки на тарелке прозрачные, равномерно розового цвета, не содержат хлопьев и зёрен. Возможны следующие четыре комбинации реакций агглютинации со стандартными сыворотками I(0), II(А), III(В) групп.

1. Все три сыворотки в обеих сериях не дают агглютинации. Исследуемая кровь - I(0) группы.

2. Реакция изогемагглютинации отрицательная с сывороткой II(А) группы обеих серий и положительная с сыворотками I(0) и III(В) групп. Исследуемая кровь - II(А) группы.

3. Реакция изогемагглютинации отрицательная с сывороткой III(В) группы в обеих сериях и положительная с сывороткой I(0) и III(А) групп. Исследуемая кровь - III(В) группы.

4. Сыворотки I(0), II(А), III(В) групп дают положительную реакцию в обеих сериях. Кровь принадлежит к IV(АВ) группе. Но прежде чем дать такое заключение, необходимо провести реакцию изогемагглютинации со стандартной сывороткой IV(АВ) группы по той же методике. Отрицательная реакция изогемагглютинации позволяет окончательно отнести исследуемую кровь к IV(АВ) группе.

Выявление других комбинаций свидетельствует о неправильном определении групповой принадлежности крови больного.

Сведения о группе крови больного вносят в историю болезни, делают соответствующую отметку на титульном листе за подписью врача, проводившего исследование, с указанием даты исследования.

Ошибки при определении групповой принадлежности крови возможны в ситуациях, когда при фактическом наличии агглютинации она не выявляется или, наоборот, выявляется агглютинация при её фактическом отсутствии. Невыявленная агглютинация может быть обусловлена: 1) слабой активностью стандартной сыворотки или низкой агглютинабельностью эритроцитов; 2) избыточным количеством исследуемой крови, добавляемой к стандартной сыворотке; 3) замедленной реакцией агглютинации при высокой температуре окружающей среды.

Чтобы избежать ошибок, необходимо использовать активные, с достаточно высоким титром сыворотки при соотношении объёма исследуемой крови и стандартной сыворотки 1:5, 1:10. Исследование проводят при температуре не выше 25 ° С, оценивать результаты следует не ранее чем через 5 мин от начала исследования.

Выявление агглютинации при её фактическом отсутствии может быть обусловлено подсыханием капли сыворотки и образованием «монетных» столбиков эритроцитов или проявлением холодовой агглютинации, если исследование проводят при температуре окружающей среды ниже 15 ° С. Добавление капли изотонического раствора хлорида натрия к исследуемой крови и сыворотке и проведение исследований при температуре выше 15 ° С позволяют избежать указанных ошибок. Ошибки в определении группы крови всегда связаны с нарушением методики исследования, поэтому необходимо тщательное соблюдение всех правил исследования.

Во всех сомнительных случаях необходимо повторное исследование групповой принадлежности со стандартными сыворотками других серий или с помощью стандартных эритроцитов.

Определение группы крови по системе АВ0 с помощью моноклональных антител анти-А и анти-В (цоликлоны анти-А и анти-В )

Цоликлоны анти-А и анти-В применяют для определения группы крови человека по системе АВ0 вместо стандартных изогемагглютинирующих сывороток путём выявления антигенов А и В в эритроцитах стандартными антителами, содержащимися в цоликлонах.

Моноклональные антитела анти-А и анти-В продуцируются двумя различными гибридомами, полученными в результате слияния мышечных антителообразующих В-лимфоцитов с клетками мышиной миеломы. Названные цоликлоны представляют собой разведённую асцитическую жидкость мышей-носителей гибридомы, содержащую IgM против антигенов А и В. Цоликлоны дают более быструю и более выраженную реакцию агглютинации, чем стандартные АВ0-сыворотки.

Определяют группу крови при температуре от 15 до 25 °С. На фарфоровую пластину или маркированную тарелку наносят по одной большой капле цоликлонов анти-А и анти-В, рядом наносят каплю исследуемой крови в 10 раз меньшего размера и смешивают отдельными палочками или уголками предметных стекол. Пластинку слегка покачивают и наблюдают за реакцией в течение 2,5 мин. Реакция обычно наступает в первые 3-5 с и проявляется образованием мелких красных агрегатов, а затем хлопьев. Возможны следующие варианты реакции агглютинации.

1. Агглютинация отсутствует с цоликлонами анти-А и анти-В, кровь не содержит агглютиногенов А и В - исследуемая кровь группы I (0) (рис. 38, см. цв. вкл.).

2. Агглютинация наблюдается с цоликлонами анти-А, эритроциты исследуемой крови содержат агглютиноген А - исследуемая кровь группы II(А).

3. Агглютинация наблюдается с цоликлоном анти-В, эритроциты исследуемой крови содержат агглютиноген В - исследуемая кровь группы III (В).

4. Агглютинация наблюдается с цоликлонами анти-А и анти-В, эритроциты содержат агглютиногены А и В - исследуемая кровь группы IV(АВ) (табл. 2).

Таблица 2.

Реакция агглютинации исследуемых эритроцитов с цоликлонами анти-А и анти-В

При наличии реакции агглютинации с цоликлонами анти-А и анти- В [группа крови IV(АВ)] для исключения неспецифической агглютинации производят дополнительное контрольное исследование с изотоническим раствором хлорида натрия. Большую каплю (0,1 мл) изотонического раствора смешивают с маленькой (0,01 мл) каплей исследуемой крови. Отсутствие агглютинации подтверждает принадлежность исследуемой крови к IV(АВ) группе. При наличии агглютинации проводят определение группы крови с использованием отмытых стандартных эритроцитов.

Цоликлоны анти-А и анти-В выпускаются в жидком виде в ампулах или флаконах, жидкость окрашена в красный (анти-А) и синий (анти- В) цвета. Хранят в холодильнике при температуре 2-8 °С. Срок хранения 2 года.

StudFiles.ru

В. Перекрёстный способ определения групп крови системы ав0.

Это одновременное распознавание антигенов в эритроцитах исследуемой крови с помощью стандартных сывороток (цоликлонов) и выявление антител, содержащихся в сыворотке этой крови, с помощью стандартных эритроцитов.

Определение группы крови системы АВ0 стандартными эритроцитами

Необходимы стандартные эритроциты трёх групп крови 0(I); А(II); В(III). Стандартные эритроциты группы 0(I) являются контрольными (в них нет антигеновАиВ). Стандартные эритроциты приготавливают на СПК из крови доноров с заранее известной группой крови; хранят при +40+50+ 60С. Срок годности 2 года. Для определения группы крови, в пробирку берут 3 – 5 мл крови (без стабилизатора). Кровь должна отстояться или её центрифугируют для разделения на сыворотку и эритроциты. На тарелку наносят в три точки по одной большой капле (0,1мл) сыворотки исследуемой крови из пробирки, а рядом с ними (соответственно маркировке) – по одной маленькой капле (0,01мл) стандартных эритроцитов групп 0(I), А(II), В(III).

Дальнейшие действия проводятся подобно определению группы крови стандартными сыворотками: соответствующие капли исследуемой сыворотки и стандартных эритроцитов смешивают отдельными стеклянными палочками (уголками предметного стекла), пластинку периодически покачивают и наблюдают за реакцией.

В те капли, где наступила агглютинация, но не ранее, чем через три минуты, добавляют по одной капле изотонического раствора, перемешивают и продолжают наблюдение при периодическом покачивании пластинки до истечения 5 минут. После чего оценивают результаты исследования.

Одновременно с вышеописанным исследованием со стандартными эритроцитами проводится исследование со стандартными сыворотками по ранее изложенному способу.

При определении групповой принадлежности крови перекрёстным способом оценивают данные, полученные при обеих реакциях (со стандартными сыворотками и стандартными эритроцитами).Результат перекрёстного способа считается достоверным, если, при оценке результатов исследований со стандартными сыворотками и со стандартными эритроцитами, совпадают ответы о группе исследуемой крови.

Если этого совпадения не происходит, исследования следует вновь переделать.

Результаты реакций со стандартными эритроцитами

Сыворотка исследуемой крови содержит антитела

Исследуемая кровь принадлежит к группе

В(III)

А(II)

О(I)

эритроцитарный антиген В.

эритроцитарный антиген А.

В эритроцитах нет антигенов А и В.

+

+

-

анти – А

и

анти – В

О(I)

+

-

-

анти – В

А(II)

-

+

-

анти – А

В(III)

-

-

-

не содержит антител «анти –А» и «анти- В».

АВ(IV)

Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации;

Знаком минус (-) обозначено отсутствие агглютинации

3. Резус-фактор. Определение резус-принадлежности

В эритроцитах 85 % людей имеется особый антиген, названный Резус-фактором (антиген D). Такие люди считаются резус-положительными, а остальные 15%, не имеющие в крови Резус-фактора (антигена D), — резус-отрицательными. Резус-фактор (антиген D) передается по наследству как аутосомный доминантный признак.

В отличие от групповых агглютининов системы АВ0, в крови человека не содержится, подобных агглютининам α и β, естественных антител к Резус-фактору (антигену D). Их появление всегда связано с иммунизацией, т.е. попаданием в организм Резус-фактора (антигена D) . Самой частой причиной такой иммунизации является беременность резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом, который унаследовал Резус-фактор (антиген D) от отца.

Антирезусные антитела могут вырабатываться также при ошибочном переливании резус-отрицательному реципиенту резус-положительных эитроцитов крови. При последующей такой гемотрансфузии может возникнуть тяжелое осложнение, связанное с резус-несовместимостью.

И, наконец, возможна искусственная иммунизация отобранных резус-отрицательных доноров-мужчин по специальной схеме малыми порциями резус-положительной крови. Такая иммунизация проводится для последующего получения от этих доноров антирезусной сыворотки. Таким образом, в отличие от групповых факторов системы АВ0, антитела к Резус-фактору (антигену D) всегда иммунные и требуют специальных методов для их выявления.

В настоящее время установлено, что помимо Резус-фактора существует около 40 родственных антигенов, объединяемых в систему антигенов DCE(илиRh-hr) — систему «Резус». Фактор С встречается у 70% людей, факторE- у 30%.

Резус-отрицательная кровь — это кровь, содержащая антигены системы Резус в таких количествах и разновидностях, которые не имеют существенного значения и не учитываются при переливании крови.

В эритроцитах резус-отрицательных людей имеются также факторы системы «резус», обозначаемые символами d, с, е. Факторы «С», «Е», «с» и «е» причиной трансфузионных реакций и осложнений бывают редко, причем последние чаще наблюдаются в акушерской практике. Их частота и тяжесть находятся в прямой зависимости от числа беременностей, родов, абортов и гемотрансфузий.

Наиболее частой причиной посттрансфузионных реакций и осложнений в системе «Резус» является антиген D: по своей антигенности (способности выработки антител) он занимает второе место после антигенов А и В.

Определение резус-принадлежности кровиявляется обязательным у всех доноров и больных, которым назначается гемотрансфузия, так же, как и определение группы крови системы АВ0. Оно проводится в лаборатории специалистом, прошедшим специальную подготовку, — лаборантом или врачом. Наиболее часто в лечебной практике используются два метода: определение резус-принадлежности в пробирке с помощью сыворотки (реагента) анти-D и реакция агглютинации на плоскости с помощью цоликлона анти-D (моноклональных анти-Dантител).

Определение резус-принадлежности в пробирке с помощью антирезусной сыворотки (сыворотки анти-D).Для этого метода используется стандартный универсальный реагент, представляющий собой сыворотку анти-D с добавлением 33 % полиглюкина в качестве коллоидной среды. Для исследования может быть использована свежая несвернувшаяся кровь, взятая из пальца (из вены) непосредственно перед использованием, или консервированная кровь без предварительной обработки, а также эритроциты из пробирки после формирования сгустка и отстаивания сыворотки. Допускается хранить образец крови до определения в холодильнике при температуре от +4 до +6 °С в течение 2 — 3 суток.

Методика проведения. Исследование проводят в центрифужных пробирках объемом не менее 10 мл. На дно пробирки вносят каплю стандартного универсального реагента анти-D, представляющего собой антирезусную сыворот­ку группы АВ (IV), содержащую 33% раствор полиглюки­на. Затем в нее добавляют одну каплю исследуемой крови (или эритроцитов). Наклоном и круговым вращением пробирки содержимое размазывают по стенкам. Это значительно ускоряет агглютинацию и делает ее крупнолепестковой. Агглютинация на стенках пробирки наступает, как прави­ло, в течение первой минуты, но для образования устой­чивого комплекса антиген — антитело и четкой агглюти­нации наблюдать следует не менее 3 мин. Затем для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавляют 3 мл физиологического раствора и перемешивают путем 3-х кратного перевертывания про­бирки (без взбалтывания).

Оценка результатов. Пробирку просматривают на свет. Результат определяется по наличию или отсутствию агглютинации. Наличие агглютинации (круп­ные хлопья на фоне просветленной жидкости) указывает на резус-положительную принадлежность исследуемой крови. Отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная розовая жидкость) свидетельствует о резус-отрицательной принадлежности исследуемой крови.

Реакция агглютинации на плоскости с помощью цоликлонов анти-D.Используется специальный реагент, содержащий антитела к резус-фактору (цоликлон анти-D супер или аналогичные). На пластинку или планшет наносят большую каплю (около 0,1 мл) реагента, а рядом маленькую каплю (0,02 мл) исследуемых эритроцитов. Тщательно смешивают реагент с эритроцитами стеклянной палочкой (уголком предметного стекла). Через 10 — 20 секунд начинают мягко покачивать пластинку. Несмотря на то, что четкая агглютинация наступает почти мгновенно, результаты реакции учитывают через 3 минуты после смешивания. При наличии агглютинации исследуемая кровь маркируется как резус-положительная, при отсутствии — как резус-отрицательная.

Подробные сведения по вопросу «Определение резус–принадлежности крови»

Определение резус–принадлежности крови больного заключается в выявлении в эритроцитах исследуемой крови антигена Rhо(D). Из входящих в систему Резус шести основных эритроцитарных антигенов (D–d; С – с; Е – е) наиболее активным является антигенRhо(D), который и подразумевается под термином «Резус–фактор». Именно по наличию или отсутствию антигена эритроцитовRhо(D) делят реципиентов на резус–положительных и резус–отрицательных.

Для определения резус – принадлежности чаще используют два экспресс – метода.

А. Определение резус–принадлежности крови стандартным универсальным реагентом антирезус (анти - D) в пробирке без подогрева.

Этим универсальным реагентом является антирезусная сыворотка, лишённая групповых антител «анти–А» и «анти–В»; она пригодна для определения резус – принадлежности крови любой группы системы АВ0.

StudFiles.ru

Читайте также