Методика определения группы крови и резус фактора

/ темы / 6 ПЕРЕЛИВАНИЕ КРОВИ И КРОВЕЗАМЕНИТЕЛЕЙ

Способы определения группы крови

Групповую принадлежность крови по системе АВ0 определяют с помощью реакции агглютинации. В настоящее время используют три способа определения групп крови по системе АВ0:

• с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток;

• с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток и стандартных эритроцитов (перекрёстный способ);

• с помощью моноклональных антител (цоликлонов анти-А и анти-В).

Существует следующая общепринятая тактика при определении группы крови.

При плановом исследовании врач стационара определяет группу крови с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток, или цоликлонов, после чего посылает кровь в серологическую лабораторию для проверки группы перекрёстным методом.

Группу крови считают определённой только в том случае, если лаборатория подтвердила данные, полученные врачом стационара. Если результаты исследований расходятся, оба исследования нужно повторить.

При необходимости определения группы крови в экстренном порядке (при кровотечении необходимо срочное переливание крови) врач стационара определяет группу крови сам (в лаборатории перепроверку выполняют, но постфактум). В таких случаях также используют реакции с изогемагглютинирующими сыворотками (или поликлонами), но при возможности целесообразно применение пе- рекрёстного метода.

Определение групп крови с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток

Этот способ в настоящее время наиболее распространён в клинической и лабораторной практике.

Суть метода сводится к обнаружению в исследуемой крови групповых антигенов А и В с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток. Для этого используют реакцию агглютинации. Постановку реакции проводят в помещении с хорошим освещением при температуре 15-25?С.

Необходимое оснащение

1. Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки групп 0(I), A(II), В(III) и АВ(IV) двух различных серий. Сыворотки для определения групп крови изготавливают в специальных серологических ла- бораториях из донорской крови. Сыворотки хранят при температуре 4-8 ?С (в холодильнике). Срок годности сыворотки указан на этикете. Титр сыворотки (также указан на этикетке) должен быть не ниже 1:32 (для сыворотки В(Ш) - не ниже 1:16/32). Под титром сыворотки понимают то максимальное её разведение, при котором может наступать реакция агглютинации. Сыворотка должна быть прозрачной. Для удобства стандартные гемагглютинирующие сыворотки различных групп подкрашивают так, чтобы они имели определённый цвет: 0(I) - бесцветная, А(II) - синяя, В(III) - красная, АВ(IV) - ярко-жёлтая. Следует отметить, что указанные цвета сопутствуют всем этикеткам на препаратах крови, имеющих групповую принадлежность (кровь, эритроцитарная масса, плазма и др.).

2. Белые фарфоровые или эмалированные тарелки, или любые другие; пластинки со смачиваемой поверхностью, маркированные 0(I), А(П), В(Ш), AB(IV).

3. Изотонический раствор хлорида натрия.

4. Иглы, пипетки, стеклянные палочки (предметные стёкла).

Методика проведения реакции

1. Перед началом реакции подписывают тарелку (наносят фамилию и инициалы исследуемого), после чего на неё под соответствующие обозначения наносят стандартные изогемагглютинирующие сыворотки I, II и III групп в объёме 0,1 мл (капля около 1 см в диаметре). Во избе- жание ошибок наносят две серии сывороток каждой из групп, так как одна из серий может иметь низкую активность и не дать чёткой агглютинации. Всего получается шесть капель, образующих два ряда по три капли в следующем порядке слева направо: 0(I), А(П), В(Ш).

2. Кровь для исследования берут из пальца или из вены. Шесть капель исследуемой крови величиной приблизительно с булавочную головку (0,01 мл, маленькая капля) последовательно переносят сухой стеклянной палочкой на пластину в шесть точек, каждую - рядом с каплей стандартной сыворотки (количество исследуемой крови должно быть приблизительно в 10 раз меньше количества стандартной сыворотки, с которой её смешивают), потом их осторожно с помощью стеклянных палочек с закруглёнными краями перемешивают.

Возможна более простая методика: на тарелку наносят одну большую каплю крови, из которой её забирают уголком предметного стекла и переносят в каждую каплю сыворотки, аккуратно перемешивая с последней. При этом всякий раз кровь берут новым уголком стекла, следя за тем, чтобы капли не сливались.

3. После смешивания тарелку периодически покачивают.

Агглютинация начинается в течение первых 10-30 с, однако наблюдение следует обязательно вести до 5 мин ввиду возможности более поздней агглютинации, например с эритроцитами группы A₂(II).

4. В те капли, где произошла агглютинация, добавляют по одной капле изотонического раствора хлорида натрия, после чего оценивают результат реакции.

Трактовка результатов

Реакция агглютинации может быть положительной или отрицательной. При положительной реакции обычно в течение первых 10- 30 с в смеси появляются видимые невооружённым взглядом мелкие красные зёрнышки (агглютинаты), состоящие из склеенных эритроцитов. Мелкие зёрнышки постепенно сливаются в более крупные зёр- на, а иногда в хлопья неправильной формы. При этом сыворотка частично или полностью обесцвечивается. Положительная реакция может быть пескообразной или лепестковой (рис. 6-1).

Рис. 6-1. Виды агглютинации: а - агглютинации нет; б - пескообразная агглютинация; в - лепестковая агглютинация

При отрицательной реакции капля остаётся равномерно окрашенной в красный цвет, в ней не обнаруживают никаких зёрнышек (агглютинатов).

Результаты реакций в каплях с сыворотками одной и той же группы (двух серий) должны совпадать.

Принадлежность исследуемой крови к соответствующей группе определяют по наличию или отсутствию агглютинации при реакции с соответствующими сыворотками после наблюдения в течение 5 мин (табл. 6-2).

При этом следует отметить, что если сыворотки всех трёх групп дали положительную реакцию, это указывает на то, что испытуемая кровь содержит оба агглютиногена (А и В) и принадлежит к группе AB(IV). Однако в таких случаях для исключения неспецифической реакции агглютинации необходимо провести дополнительное контрольное исследование испытуемой крови со стандартной изогемагглютинирующей сывороткой группы AB(IV), не содержащей агглю-

Таблица 6-2. Оценка результатов реакции со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками

тининов. Лишь отсутствие агглютинации в этой капле при наличии агглютинации в каплях, содержащих стандартные сыворотки групп 0(I), А(II) и В(III), позволяет считать реакцию специфической и отнести исследуемую кровь к группе АВ₀(IV).

Следует отметить, что при наличии в исследуемой крови слабого антигена А₂ реакция агглютинации с гемагглютинирующими сыворотками групп 0(I) и B(III) начинается позже (на 3-4-й мин).

Идентификацию подгрупп антигена А проводят в серологической лаборатории с помощью специальных экстрактов из семян Dolichos biflorus и Ulex Europeus. Первый из них агглютинирует эритроциты с антигеном А₁, но не реагирует с антигеном А₂, а второй - наоборот.

Определение групп крови перекрёстным способом

Способ наиболее часто используют в серологических лабораториях. Суть метода состоит в определении наличия или отсутствия в исследуемой крови групповых антигенов А и В с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток, а также групповых антител α и β с помощью стандартных эритроцитов. Реакцию со стандартными сыворотками проводят описанным выше способом.

Реакцию со стандартными эритроцитами проводят следующим образом.

Необходимое оснащение

Оснащение для реакции со стандартными эритроцитами отличается тем, что для её проведения необходимы стандартные эритроци- ты трёх групп крови: 0(I), А(II), B(III). Стандартные эритроциты при- готавливают из крови доноров с заранее известной группой крови, хранят при 4-8 ?С. Срок годности 2-3 дня.

Методика проведения реакции

1. Кровь для исследования берут из вены в сухую пробирку, центрифугируют или оставляют в покое на 20-30 мин для получения сыворотки.

2. На маркированную тарелку пипеткой наносят три больших капли (0,1 мл) сыворотки исследуемой крови из пробирки, а рядом с ними - по одной маленькой капле (0,01 мл) стандартных эритроцитов групп.

3. Дальнейшие мероприятия проводят аналогично методу с использованием стандартных изогемагглютинирующих сывороток: соответствующие капли смешивают стеклянными палочками, планшет по- качивают, наблюдают в течение 5 мин, в капли с агглютинацией

Таблица 6-3. Оценка результатов определения группы крови перекрёстным способом

добавляют изотонический раствор хлорида натрия, после чего оценивают результат.

Трактовка результатов

Оценивают данные, полученные при обеих реакциях (со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и стандартными эритроцитами - табл. 6-3).

Особенность трактовки результатов реакции со стандартными эритроцитами - эритроциты группы 0(I) считают контрольными (в них нет антигенов, что делает принципиально невозможной специфическую реакцию агглютинации с любой сывороткой).

Результат перекрёстного способа считают достоверным, только если при оценке результатов реакции со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и со стандартными эритроцитами ответы о группе исследуемой крови совпадают. Если этого не происходит, обе реакции следует переделать.

Определение групп крови моноклональными антителами Необходимое оснащение

Для определения группы крови используют моноклональные антитела, для получения которых применяют гибридомную биотехнологию.

Гибридома - клеточный гибрид, образованный путём слияния клетки опухоли костного мозга (миеломы) с иммунным лимфоцитом, синтезирующим специфические моноклональные антитела. Гибридома приобретает свойства обоих «родителей»: способность к нео-

Таблица 6-4. Схема оценки результатов определения групп крови с помощью моноклональных антител (цоликлоны анти-А и анти-В)

граниченному росту, характерную для опухолевой клетки, и возможность синтезировать антитела, присущую иммунному лимфоциту.

Разработаны стандартные реагенты - моноклональные антитела: цоликлоны анти-А и анти-В, применяемые для определения агглютиногенов эритроцитов. Цоликлоны используют в виде лиофилизированного порошка красного (анти-А) или синего (анти-В) цвета, порошок разводят изотоническим раствором натрия хлорида непосредственно перед исследованием.

Техника проведения реакции

Цоликлоны анти-А и анти-В наносят на белый планшет по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями: анти-А и анти-В. Рядом с ними наносят по одной маленькой капле (0,01 мл) исследуемой крови. После перемешивания составных частей за реакцией агглютинации наблюдают в течение 2-3 мин.

Трактовка результатов

Оценка результатов очень проста (табл. 6-4).

Методика определения группы крови с помощью цоликлонов позволяет отказаться от стандартных изогемагглютинирующих сыворо- ток, получаемых из донорской крови.

Возможные ошибки

Определение групповой принадлежности с помощью реакции агглютинации может сопровождаться ошибками, ведущими к неверной трактовке результатов. Все ошибки можно разделить на три группы:

• низкое качество реагентов;

• технические ошибки;

• особенности исследуемой крови.

Низкое качество реагентов

Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки и стандартные эритроциты могут иметь низкие агглютинабельные свойства, что при- водит к неверному толкованию результатов реакции. Во избежание подобных ошибок нужно следить за сроком годности, условиями хранения и внешним видом реагента (прозрачность сыворотки, отсутствие плёнок, хлопьев, запаха гниения и пр.).

Технические ошибки

Ошибки технического характера связаны с несоблюдением или недостаточно точным выполнением всех правил проведения реакции.

Несоблюдение внешних условий

Плохая освещённость мешает обнаружить агглютинацию или её отсутствие.

Повышение температуры выше 25 ?С резко замедляет реакцию.

При низкой температуре (ниже 15 ?С) может произойти неспецифическая агглютинация, независимо от состава агглютининов и агглютиногенов - так называемая холодовая панагглютинация (агглю- тинация возникает при реакциях с сыворотками всех групп крови). Это происходит из-за наличия в сыворотке особого холодового агглютинина, способного давать реакцию агглютинации только при низких температурах.

Неправильное проведение самой реакции

Нарушение расположения сывороток, соотношения сыворотки и крови, слияние соседних капель создают возможность неправильной интерпретации полученных результатов.

Ранняя оценка результатов также может привести к ошибке, особенно при наличии слабого антигена А₂, дающего позднюю агглютинацию.

Недобавление физиологического раствора. Несоблюдение этого простого правила (в капли, где произошла агглютинация, следует добавить изотонический раствор хлорида натрия) может привести к тому, что за специфическую агглютинацию принимают ложную (псевдоагглютинацию). Под термином «псевдоагглютинация» подразумевают способность эритроцитов склеиваться в «монетные столбики», или «кучки», с сохранением мембран, независимо от их агглютинабельных свойств. Границы между форменными элементами хорошо

видны под микроскопом, в отличие от истинной агглютинации, при которой происходит разрушение мембран эритроцитов. Добавление 1-2 капель изотонического раствора хлорида натрия позволяет дифференцировать истинную агглютинацию от ложной. Псевдоагглютинация расходится довольно быстро, в то время как истинная агглютинация сохраняется прежней или становится более выраженной.

Особенности исследуемой крови

Развитие неспецифической панагглютинации может быть связано не только с низкой температурой, но и с качествами самой крови.

Панагглютинацию при бактериальном заражении исследуемой крови в 1927 г. описал Томсен. Этот феномен (феномен Томсена) характеризуется агглютинацией крови с сыворотками всех групп и сывороткой собственной крови.

Сущность явления заключается в том, что сыворотка при комнатной температуре даёт агглютинацию со всеми эритроцитами, даже со своими собственными (аутоагглютинация), а эритроциты в то же время дают агглютинацию со всеми сыворотками, даже с сыворотками группы AB(IV).

Подобное явление описано при различных заболеваниях: болезнях крови, спленомегалии, циррозе печени, инфекционных заболеваниях и т.д. Панагглютинацию крайне редко наблюдают и у здоровых людей. Панагглютинацию и аутоагглютинацию выявляют только при комнатной температуре; при температуре, близкой к температуре человеческого тела, этих явлений не происходит.

Во избежание ошибок необходимо не допускать определения группы крови при температуре ниже 15 ?С. Если при определении групповой принадлежности агглютинация происходит с сыворотками групп 0(I), A(II) и B(III) всегда следует проводить реакцию с сывороткой группы AB(IV). Только в том случае, если в этой капле не будет агглютинации, можно исключить панагглютинацию и отнести кровь к группе AB₀(IV). При наличии агглютинации с сывороткой AB(IV) необходимо подогреть кровь до 37 ?С и провести реакцию при этой температуре, при этом панагглютинация и аутоагглютинация исчезают.

При некоторых заболеваниях отмечают снижение агглютинабельности агглютиногенов эритроцитов (хронические инфекционные за- болевания, онкологические заболевания, болезни крови и др.). При этом так же, как и при наличии слабого антигена A₂, следует чётко соблюдать условия и время реакции.

Во всех случаях нечёткого или сомнительного результата необходимо повторное определение группы крови при помощи стандартных сывороток других серий, а также перекрёстным способом.

Определение резус-фактора Антигенная система резус-фактора

В 1940 г. К. Ландштейнер и А. Винер обнаружили в эритроцитах человека совершенно новый антиген, названный ими резус-фактором (Rh). Резус-фактор присутствует в крови 85% людей, а у 15% отсутствует.

Система антигенов резус представлена пятью основными антигенами: D, C, с, Е, e (ранее считали, что их шесть, но позже было доказано, что аллельного гена d не существует). C и с, а также Е и e - аллельные антигены. Каждая из хромосом несёт только три гена из пяти: D, С или с, Е или е.

Номенклатура Dd, Cc, Ее была предложена Р. Фишером и Р. Рейсом. Другая номенклатура (Rh-Hr) была введена А. Винером. Он обозначил шесть резус-антигенов следующим образом: Rh₀ (D), rh'(C), rh»(E), Hr_o(d), hr'(c), hr»(e).

Указанные пять антигенов резус (исключая антиген d) встречают в эритроцитах в виде одного из 18 возможных сочетаний (табл. 6-5). Фенотипически каждый человек содержит 5, 4 или 3 антигена резус в зависимости от количества генов, по которым он гомозиготен. Однако генотипическую формулу изображают шестью буквами, например, cDE/CDe, обозначающими три гена резус, унаследованных с хромосомой одного из родителей, три - с хромосомой другого.

Наиболее активен из всех антигенов Rh_o(D) - резус-фактор. В зависимости от его наличия или отсутствия кровь людей делят на резус-положительную (Rh+) и резус-отрицательную (Rh-).

Иначе подходят к оценке резус-принадлежности доноров. Необходимо дополнительное исследование крови доноров по факторам Е и С. Резус-отрицательными могут быть только доноры, в крови которых отсутствуют все три антигена (D, С, Е). Такой подход к оценке резус-принадлежности доноров позволяет исключить возможность сенсибилизации реципиента к любому из трёх основных антигенов:

Rh_o(D), rh'(C), rh»(E).

В повседневной практике переливания крови ограничиваются определением у реципиента только антигена Rh_o(D).

Таблица 6-5. Aнтигенные группы системы резус-фактор (по M.A. Умно- вой, 1983)

Существует подтип этого антигена Du, отличающийся по структуре и количеству экспрессируемых молекул на строме эритроцитов. Иммуногенность антигена Du значительно снижена, и выявить его сложнее, чем резус-фактор. Подтип Du имеет существенное значение, так как приводит к синтезу особых антител. Они могут стать причиной развития резус-несовместимости крови донора и реципиента. При наличии Du кровь реципиента считают отрицательной, а кровь донора - положительной.

Aнтигены резус - липопротеиды. Они очень активны и способны вызывать образование иммунных антител. Резус-антитела, будучи иммунными (неполными, моновалентными, блокирующими), могут фиксироваться к резус-положительным эритроцитам, не вызывая их склеивания. Они агглютинируют эритроциты только в присутствии коллоидных растворов, протеолитических ферментов или под действием специально приготовленной антиглобулиновой преципитирующей сыворотки. Неполные антитела относят к иммуноглобулинам класса G.

Наличие резус-антигена выявляют у эмбриона начиная с 5-8-й нед, оно хорошо выражено на сроке гестации 3-4 мес. Существова-

ние антигенов системы резус в эритроцитах человека - физиологическое явление, антител к этим антигенам в организме людей с резус-положительными эритроцитами нет. Образование иммунных антител происходит при поступлении в организм человека чужеродного ему изоантигена. У сенсибилизированных людей с резус-отрицательными эритроцитами антитела анти-D содержатся не только в крови, но и в экссудате, транссудате, моче, слезе и других средах.

Способы определения резус-фактора

Все методы определения резус-фактора делят на способы, применяемые в клинической практике, и лабораторные способы.

Способы определения Rh₀(D) в клинической практике

В клинических условиях (в приёмном покое, хирургическом отделении, операционной), где нет специального лабораторного оборудования, используют экспресс-методы определения Rh_o(D) (D-фактора).

Экспресс-метод определения стандартным универсальным реагентом в пробирке без подогрева

Для исследования можно использовать свежую несвернувшуюся кровь, взятую из пальца (или вены) непосредственно перед исследованием, или консервированную кровь без предварительной обработки, а также эритроциты из пробирки после формирования сгустка и отстаивания сыворотки.

Методика проведения реакции. Исследование проводят в центрифужных пробирках объёмом не менее 10 мл. На дно пробирки вносят одну каплю стандартного универсального реагента, представляющего собой антирезусную сыворотку группы АВ(IV), разведённую 33% раствором декстрана (ср. мол. масса 50 000-70 000). Затем в неё добавляют одну каплю исследуемой крови (или эритроцитов). Круго- вым вращением пробирки содержимое размазывают по её внутренней поверхности таким образом, чтобы содержимое растеклось по стенкам. Это значительно ускоряет агглютинацию и делает её крупнолепестковой. Агглютинация на стенках пробирки наступает, как правило, в течение первой минуты, но для образования устойчивого комплекса антиген-антитело и чёткой агглютинации наблюдать следует не менее 3 мин. Затем для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавляют 2-3 мл физиологического

раствора и перемешивают путём одно-двукратного перевертывания пробирки (без взбалтывания!).

Трактовка результатов. Наличие агглютинации (крупные хлопья на фоне просветлённой жидкости) указывает на резус-положительную принадлежность исследуемой крови. Отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная розовая жидкость) свидетельствует о резус-отрицательной принадлежности исследуемой крови.

Лабораторные способы определения резус-фактора

Для определения резус-принадлежности крови больного в условиях лаборатории применяют четыре основных метода.

Метод агглютинации в солевой среде

Используют специальные сыворотки, содержащие полные антитела анти-резус. Эритроциты в виде 2% взвеси в изотоническом ра- створе хлорида натрия соединяют в пробирках с антирезусной сывороткой. Пробирки помещают на 1 ч в термостат при температуре 37 ?С, после чего осадок эритроцитов на дне пробирки рассматривают с помощью лупы и по его форме учитывают результат. При положительном результате (Rh+) осадок имеет характерный рисунок в виде нитей или зернистости. При отрицательном (Rh-) осадок размещается равномерным слоем и имеет вид правильно очерченного круга.

Метод агглютинации в присутствии желатина

B две пробирки помещают по 0,02-0,03 мл осадка исследуемых эритроцитов. Затем в первую пробирку добавляют 2 капли (0,1 мл) 10% раствора желатина и 2 капли (0,1 мл) анти-резусной сыворотки, во вторую (контрольную) пробирку - 2 капли (0,1 мл) 10% раствора желатина и 2 капли (0,1 мл) физиологического раствора.

Содержимое осторожно перемешивают. Затем пробирки инкубируют в термостате при температуре 45-48 ?С в течение 30 мин, после чего добавляют 5-8 мл физиологического раствора и переворачивают пробирки 1-2 раза для перемешивания.

Результат учитывают, просматривая пробирки на свет невоору- жённым глазом или через лупу. Eсли эритроциты резус-положи- тельны, произойдёт их агглютинация. Отсутствие агглютинации свидетельствует о том, что испытуемая кровь резус-отрицательная. B контрольной пробирке агглютинация эритроцитов должна отсутствовать.

Непрямой антиглобулиновыи тест (реакция Кумбса)

Эта реакция наиболее чувствительна для выявления неполных антител к ауто- и изоантигенам эритроцитов. К ней, как правило, прибегают при возникновении трудностей в определении резус-при- надлежности крови, связанных с нечёткими результатами, полученными при других методах исследования. Реакция основана на использовании антиглобулиновой сыворотки.

При обработке резус-положительных эритроцитов неполными антителами анти-Rh наступает их обволакивание, сенсибилизация по отношению к антиглобулиновой сыворотке, которая агглютинирует сенсибилизированные эритроциты, поскольку имеет антитела к глобулинам.

В пробирку вносят антирезусную сыворотку и отмытые физиологическим раствором эритроциты, помещают на 1 ч в термостат при температуре 37 ?С, после чего эритроциты тщательно отмывают. Последующий этап реакции проводят на плоскости. Каплю взвеси эритроцитов смешивают с равным количеством антиглобулиновой сыворотки и учитывают результат. Наличие агглютинации - показатель того, что исследуемый образец крови резус-положительный. Если агглютинация отсутствует, то испытуемая кровь резус-отрицательная.

Реакция с анти-D-моноклональными антителами

На планшете смешивают большую каплю (0,1 мл) анти-D-монокло- нальных антител и маленькую каплю (0,01 мл) исследуемой крови.

За реакцией наблюдают в течение 3 мин. При смешивании анти- D-MKA с образцами резус-положительных эритроцитов отмечают быстро наступающую лепестковую агглютинацию. Если кровь резусотрицательная, агглютинация отсутствует.

Возможные ошибки

Чаще всего ошибки бывают следствием методических погрешностей при проведении исследования, в особенности при использовании конглютинационных методов. К ложным результатам могут привести неправильное соотношение между сывороткой и эритроцитами, преждевременная оценка результатов, оценка результатов по высыхающей капле, определение резус-фактора в гемолизированном и длительно хранящемся образце крови, а также использование неактивных, инфицированных и загнивших сывороток или сывороток с истекшим сроком годности.

Причиной ошибок могут быть биологические особенности испытуемой крови: снижение агглютинабельности резус-антигена при некоторых заболеваниях печени, почек, системы крови, а также неспе- цифическая агглютинация испытуемых эритроцитов. B случае сомнительных результатов исследование повторяют, применяя более активные антирезусные сыворотки.

Клиническое значение групповой дифференциации

Общие иммуногенетические аспекты

Групповые антигены и антитела крови имеют большое значение в физиологии и патологии человека. Прежде всего, надо иметь в виду, что антигены крови - маркёры генотипа каждого индивидуума. Этот факт имеет значение для плодовитости брака, течения и исхода беременности и здоровья новорождённого. Половые клетки соответственно генотипу имеют антигены, аналогичные групповым антигенам крови, а супруги часто отличаются по группе крови. Несовместимость супругов по системе резус-фактора - одна из наиболее частых причин иммунологического конфликта при беременности, приводящего к гибели плода или гемолитической болезни новорождённого.

B настоящее время всё больше появляется данных о статистически значимых связях групп крови с инфекционной и неинфекционной патологией человека. Наличие некоторых эритроцитарных и лей- коцитарных антигенов создаёт условия для большей вероятности некоторых заболеваний. B частности, известно, что язвенная болезнь наиболее часто развивается у пациентов с группой крови A(II), а наличие антигена HLA-B₁₈ предрасполагает к заболеванию гепатитом B, а если при этом у человека имеется ещё антиген HLA-B₅, то наиболее вероятно хроническое течение заболевания. Существует оп- ределённая связь иммунологической реактивности и лейкоцитарных групп по системе HLA. Например, организм людей, имеющих антиген HLA-B₈, более активно синтезирует любые антитела, а при наличии антигена HLA-B₃₅ особенно активно образует антитела к столбнячному анатоксину. Таких примеров много. Подобные данные имеют большое значение для определения групп риска в направленной диспансеризации, а также при профессиональном отборе.

StudFiles.ru

Способы определения резус-фактора

Все методы определения резус-фактора делятся на способы, применяемые в клинике: в условиях приемного покоя, в операционной, на отделении у постели больного и т. д., не требующие специального лабораторного оснащения, и лабораторные способы.

Способы определения резус-фактора в клинике. Используются два так называемых экспресс-метода: экспресс-метод со стандартным универсальным реагентом в пробирке без подогрева. Экспресс-метод на плоскости без подогрева.

Экспресс-метод определения Rh-фактора стандартным универсальным реагентом в пробирке без подогрева.

Для исследования может быть использована свежая несвернувшаяся кровь, взятая из пальца (из вены) непосредственно перед исследованием, или консервированная кровь без предварительной обработки, а также эритроциты из пробирки после формирования сгустка и отстаивания сыворотки.

Методика проведения реакции

Исследование проводят в центрифужных пробирках объемом не менее 10 мл. На дно пробирки вносят одну каплю стандартного универсального реагента, представляющего собой антирезусную сыворотку группы АВ (IV), содержащую 33% раствор полиглюкина. Затем в нее добавляют одну каплю исследуемой крови (или эритроцитов). Круговым вращением пробирки содержимое размазывают но ее внутренней поверхности таким образом, чтобы содержимое растеклось по стенкам. Это значительно ускоряет агглютинацию и делает ее крупнолепестковой. Агглютинация на стенках пробирки наступает, как правило, в течение первой минуты, но для образования устойчивого комплекса «антиген - антитело» и четкой агглютинации наблюдать следует не менее 3 минут. Затем для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавляют 2-3 мл физиологического раствора и перемешивают путем одно-двукратного перевертывании пробирки (без взбалтывания!).

Наличие агглютинации (крупные хлопья на фоне просветленной жидкости) указывает на резус-положительную принадлежность исследуемой крови. Отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная розовая жидкость) свидетельствует о резус-отрицательной принадлежности.

Лабораторные методы определения резус-фактора

Метод агглютинации в солевой среде

Используют специальные сыворотки, содержащие полные антитела анти-резус. Эритроциты в виде 2% взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия соединяют в пробирках с антирезусной сывороткой. Пробирки помещают на 1 час в термостат при температуре 37°С, после чего осадок эритроцитов на дне пробирки рассматривают с помощью лупы и по его форме учитывают результат. При положительном результате (Rh+) осадок имеет характерный рисунок в виде нитей или зернистости. При отрицательном (Rh-) осадок размещается равномерным слоем и имеет вид правильно очерченного круга.

Метод конглютинации с желатином

В пробирку помещают равные объемы исследуемых эритроцитов, антирезусной сыворотки и 10% раствора желатина. Пробирки инкубируют при температуре 45-48є C, после чего добавляют десятикратный объем физиологического раствора. Пробирки 2-3 раза переворачивают и учитывают результат по наличию агглютинации, видимой невооруженным глазом.

Непрямой антиглобулиновый тест (реакция Кумбса)

Эта реакция является наиболее чувствительной для выявления неполных антител к ауто- и изоантигенам эритроцитов. К ней, как правило, прибегают при возникновении трудностей в определении резус-принадлежности крови, связанных с нечеткими результатами, полученными при других методах исследования. Реакция основана на использовании антиглобулиновой сыворотки (АГС). При обработке резус-положительных эритроцитов неполными антителами анти-Rh наступает их обволакивание (сенсибилизация) по отношению к АГС, которая и агглютинирует сенсибилизированные эритроциты, поскольку имеет антитела к глобулинам.

В пробирку вносят антирезусную сыворотку и отмытые физиологическим раствором эритроциты; помещают на 1 час в термостат при температуре 37°С, после чего эритроциты тщательно отмывают. Последующий этап реакции проводят на плоскости. Каплю взвеси эритроцитов смешивают с равным количеством антиглобулиновой сыворотки и учитывают результат. Наличие агглютинации является показателем того, что исследуемый образец крови резус- положительный. Если агглютинация отсутствует, испытуемая кровь - резус-отрицательная.

Реакция с aнти-D-моноклональными антителами.

На планшете смешивают большую каплю (0,1 мл) анти-D-моноклональных антител (МКА) и маленькую каплю (0,01мл) исследуемой крови. За реакцией наблюдают в течение 2,5 мин. При смешивании анти-D-МКА образцами резус-положительных эритроцитов отмечается быстрое наступающая лепестковая агглютинация. Если кровь резус-отрицательная - агглютинация отсутствует.

StudFiles.ru

Определение групп крови, резус- фактор

В средние века делались неоднократные попытки переливания крови от животных человеку и от человека человеку. Однако практически все они заканчивались трагически. Первое удачное переливание человеческой крови пострадавшему произвел 1667 году врач Дени. Причины тяжелых осложнений, возникающих при гемотрансфузиях, первым установил в 1901 году Карл Ландштейнер. Он смешивал капли крови различных людей и обнаружил, что в ряде случаев происходит склеивание эритроцитов - агглютинация и их последующий гемолиз. На основании своих опытов Ландштейнер сделал вывод, что в эритроцитах имеются белки-агглютиногены, способствующие их склеиванию. Он выявил 2 агглютиногена А и В. На основании их отсутствия или наличия в эритроцитах разделил кровь на I, II и III группы. В 1903 г. его ученик Адриано Штурли обнаружил IV группу крови. Позже в плазме крови были обнаружены белки, которые взаимодействуют с агглютиногенами и вызывают склеивание эритроцитов. Их назвали агглютининами a и b. Сейчас установлено, что антигенными свойствами обладает мембранный гликопротеид эритроцитов - гликофорин. Агглютинины являются иммуноглобулинами M и G, т.е. g-глобулины. Агглютиноген А и агглютинин a, а также агглютиноген В и агглютинин b называют одноименными. При их взаимодействии происходит склеивание эритроцитов. Поэтому в крови человека находятся только разноименные агглютиногены и агглютинины. В крови новорожденных агглютининов нет. Однако затем компоненты пищи, вещества вырабатываемые микрофлорой кишечника, способствуют синтезу тех агглютининов, которых нет в эритроцитах данного человека.

Группы крови системы АВО обозначаются римскими цифрами и дублирующим названием антигена:

I(0) - в эритроцитах нет агглютиногенов, но в плазме содержатся агглютинины a и b.

II(A) - агглютиногены А и агглютинины b.

III(B) - агглютиногены В и агглютинины a.

IV(AB) - в эритроцитах агглютиногены А и В, агглютининов в плазме нет.

В настоящее время обнаружено, что в эритроцитах I группы имеется слабый H-антиген. Агглютиногены А делятся на подтипы А1 и А2. Первый подтип встречается у 80% людей и обладает более выраженными антигенными свойствами. Реакций при переливании между кровью этих подгрупп не происходит.

Наследование группы крови осуществляется за счет генов А, В и О. В хромосомах человека содержится 2 из них. Гены А и В являются доминантными. Поэтому у родителей со II и III группой крови ребенок может иметь любую из 4-х групп.

1. ОО

2.АО

3.ОА + ОВ = ВО

4. АВ

В 1940 году К. Ландштейнер и И. Винер обнаружили в эритроцитах еще один агглютиноген. Впервые он был найден в крови макак-резусов. Поэтому был назван ими резус-фактором.

В настоящее время допускается переливание только одногрупповой крови по системе АВО. Для определения групповой принадлежности, каплю исследуемой крови смешивают на предметном стекле с каплей стандартных сывороток I, II и III групп. Таким методом определяются антигенные свойства эритроцитов. Если ни в одной из сывороток не произошла агглютинация, следовательно в эритроцитах агглютиногенов нет. Это кровь I группы. Когда агглютинация наблюдается с сыворотками I и III групп, значит эритроциты исследуемой крови содержат агглютиноген А. Т.е. это кровь II группы. Агглютинация эритроцитов с сыворотками I и II групп говорит о том, что в них имеется агглютиноген В и эта кровь III группы. Если во всех сыворотках наблюдается агглютинация, значит эритроциты содержат оба антигена А и В. Т.е. кровь IV группы. Желательно проводить исследование и с сывороткой IV группы. Более точно группу крови можно определить с помощью стандартных эритроцитов I, II, III и IV групп. Для этого их смешивают с сывороткой исследуемой крови и определяют содержание в ней агглютининов. Резус принадлежность крови определяют путем ее смешивания с сывороткой, содержащей резус-агглютинины.

Кроме этого, чтобы избежать ошибки при определении группы крови и

наличия D-антигена, применяют прямую пробу. Она необходима и для выявления несовместимости крови по другим антигенным признакам. Прямую пробу производят путем смешивания эритроцитов донора с сывороткой реципиента при 370 С. При отрицательных результатах первые порции крови переливаются дробно.

Билет №25.

studopedia.ru

Определение группы крови. Исследование Бека, резус фактора

Определение группы крови по системе AB0

Для определения группы крови простым методом необходимы 8 глазных пипеток (отдельная для каждой группы серии сыворотки), мелкая тарелка, флаконы с изотоническим раствором хлорида натрия и гемагглю-тинирующие сыворотки 4 групп двух серий.

Определение крови с помощью стандартных сывороток называется «простой реакцией». Определение производится на тарелке, на которой восковым карандашом наносят обозначения групп сывороток. Сначала на тарелку наносят по 1—2 капли стандартных сывороток соответственно сделанным надписям в 2 ряда для двух различных серий. В каждую каплю сыворотки добавляют испытуемую кровь, взятую из пальца или из вены, и перемешивают покачиванием. Количество крови должно быть в 10—15 раз меньше, чем сыворотки. За реакцией наблюдают не более 5 минут, после чего делают заключение о группе крови по наличию агглютинации.

Различают 4 классические реакции, характерные для 4 групп крови.

Агглютинация (+) при смешивании крови со стандартными сыворотками

Группа крови	Группа стандартной сыворотки
0(1)	А (II)	В(Ш)	AB(IV)
0(1)	-	-	+
А (II)	+	-	+
В(Ш)	+	-	+
АВ (IV)	+	+	-

Агглютинация, образование «песка» в капле со смесью свидетельствуют о наличии группового антигена.

Двойная перекрестная реакция в сыворотке крови больного

· Простой метод определения группового антигена (группы крови) уточняется в изосерологической лаборатории с помощью двойной перекрестной реакции — определением групповых антител а и b в исследуемой сыворотке. Они выявляются с помощью стандартных эритроцитов А и В, заготовленных от доноров, имеющих соответственно А (II) и В (III) группы крови.

· В 2 отдельные капли сыворотки, нанесенные на тарелки, добавляют стандартные эритроциты групп А и В. Через 5 минут определяют результат по наличию агглютинации, которая выявляет агглютинин а в крови В (III) группы, агглютинин b в крови А (II) группы, агглютинины а и b в крови О (I) группы и отсутствие агглютинации в крови АВ (IV) группы.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗУС-ФАКТОРА

Понятие "резус-фактор"

· У 85 % людей в крови имеется еще один агглютиноген — резус фактор (Rh), а у 15 % он отсутствует. На основании этого кровь всех людей делят на резус-положительную (Rh+) и резус отрицательную (Rh-). Резус-характеристика является наследственной и постоянна в течение всей жизни. При любом переливании крови необходимо точно определить резус-принадлежность реципиента и донора.

studopedia.ru

Методика определения группы крови с помощью цоликлонов

Различают цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ. Они представляют собой моноклональные антитела, которые продуцируются двумя мышиными гибридомами, принадлежат к иммуноглобулинам класса М и предназначены для определения группы крови человека по системе AB0. Цоликлоны изготавливаются из асцитической жидкости мышей - носителей анти-А и анти-В гибридом, являются строго специфичными и, следовательно, не могут вызывать неспецифическую агглютинацию эритроцитов. Технология приготовления реагента исключает возможность попадания в него патогенных для человека вирусов.

Цоликлон анти-АВ представляет собой смесь моноклональных анти- А и анти-В антител. Цоликлоны выпускают в жидкой форме во флаконах по 5-10 мл. Цоликлоны анти-А подкрашены в красный цвет, анти-В - в синий, анти-АВ не подкрашивают, он остается бесцветным. Срок хранения цоликлонов при температуре +2-8°С составляет два года, вскрытый флакон может храниться при той же температуре в течение одного месяца в закрытом виде.

Условия определения группы крови цоликлонами аналогичны описанным выше способам. На пластинку индивидуальными пипетками, под соответствующими надписями, наносят по одной большой капле (0,1 мл) цоликлонов анти-А, анти-В и анти-АВ. Рядом с каплями размещают по одной маленькой капле исследуемой крови (0,01-0,03 мл). Затем проводят смешивание капель отдельными палочками. Наблюдают за ходом реакции в течение трех минут, хотя агглютинация может появиться через три - шесть секунд, но возможна и поздняя реакция агглютинации, при наличии в эритроцитах слабых антигенов А или В.

Результат реакции в каждой капле может быть положительным или отрицательным. Положительный результат выражается в агглютинации эритроцитов. Агглютинаты видны невооруженным глазом в виде мелких красных комочков, быстро сливающихся в крупные хлопья. При отрицательной реакции капля остается равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты в ней не обнаруживаются.

Интерпретация результатов реакции агглютинации крови с цоликлонами представлена в таблице 5.

Таблица 5. Определение группы крови с помощью цоликлонов

Результат реакции с цоликлонами	Исследуемая кровь принадлежит к группе
Анти-А	Анти-В	Анти-АВ
-	-	0(I)
+	-	+	A(II)
-	+	B(III)
+	+	AB(IV)

Оценка результатов исследования:

1. Отсутствие агглютинации во всех каплях свидетельствует о том, что в исследуемых эритроцитах нет агглютиногенов А и В, и исследуемая кровь принадлежит к 0(I) группе.

2. Наличие агглютинации в каплях с анти-А и анти-АВ свидетельствует о том, что в исследуемых эритроцитах имеется антиген А и кровь принадлежит к A(II) группе.

3. Наличие агглютинации в каплях с анти-В и анти-АВ свидетельствует о том, что в исследуемых эритроцитах имеется антиген В и кровь принадлежит к В (III) группе.

4. Наличие агглютинации во всех каплях свидетельствует о том, что в исследуемых эритроцитах имеются оба антигена (А и В) и кровь принадлежит к АВ(IV) группе. В таких случаях необходимо исключить спонтанную неспецифическую агглютинацию исследуемых эритроцитов. Для этого производят смешивание маленькой капли исследуемой крови с каплей изотонического раствора хлористого натрия (в соотношении 1:10) и, отдельно, проверяется реакция с сывороткой четвертой группы крови. При отсутствии агглютинации эритроцитов в физиологическом растворе и в сыворотке четвертой группы можно утверждать, что исследуемая кровь принадлежит к АВ(IV) группе. Проводить отдельно контроль с растворителем цоликлонов не требуется, поскольку в нем нет каких-либо добавок, способных вызвать агглютинацию эритроцитов.

studopedia.ru